タンパク質実験プロトコル

ウェスタンブロッティングのバンドの画像が黒くならず、白くなってしまう、いわゆる「白抜け」が起きる場合があります。この原因はバンドの発光が強すぎるためです。よって、次のような方法で対処すると良いでしょう。ちなみに、上に書いている方法ほど、私個人的におすすめの方法です。各ウェルにアプライするタンパク質量...

バイオ実験をしている人が100均に行ったら思わず見てしまうのがタッパーウェア。ウェスタンブロッティングでミニゲルのメンブレン洗浄やブロッキングにピッタリなサイズのものを思わず探してしまいますよね（笑）ですが、タッパーは四隅が直角ではなく丸くなっているので、メンブレンをシェーカーで振盪中に端の部分がせ...

ウェスタンブロッティングでは、バックグランドを低く抑え、S/N比をよくすることはシグナル強度の定量性を高めるうえでとても大事です。ですが、バックグランドが高い、ムラが出てしまう、といったトラブルはつきものです。私自身もかなり苦労した経験（今も）があります。そんな中、色々と調べたり、自分自身で実験した...

ウェスタンブロッティングを行うとき、特にバンドが強くないときに気になるが「ゲルからメンブレンへのタンパク質の転写効率は良いか？」ということだと思います。特に初心者の方は、（プレステインドの）分子量マーカーがメンブレンにきれいに移っているのを見て、「転写効率が良い」と思い込んでしまいがちです。ですが、...

ウェスタンブロッティングで重要なのは各レーンに等量のタンパク質をアプライすることで、論文ではbeta-actinやalpha-tubulinなどのバンド検出を行い、各レーンで同じバンド強度であることで示しています。ですが、バンド検出の終わった後に残ったメンブレンをCBB（クマーシーブリリアントブルー...

タンパク質溶液の濃縮に用いられる実験方法であるアセトン沈殿のプロトコルです。あらかじめ必要量のアセトンを-20℃で冷やしておくタンパク質溶液の溶液量に対して4倍量以上の冷アセトンを加えて混ぜる−20℃で3時間放置（overnightまで）遠心14000g 10min上清を除去し、アセトンを乾燥させる...

ウェスタンブロッティングなどで使われるTBS-Tの調製について。ここでは、ストックするのに便利な10X（10倍濃縮）バッファーのレシピを紹介します。10X TBSストック溶液2LのレシピTrizma Base（トリス塩基） 60.6gNaCl（塩化ナトリウム）　80.6gKCl（塩化カリウム）2g上...

Western blottingで電気泳動と転写が終わると、メンブレンのブロッキングと抗原抗体反応を行います。ここで間違えやすいのがメンブレンの向き。メンブレンの方向を間違えると、どのレーンがどのサンプルか判別できなくなり、大変なことになります。そこで上下左右の区別をつけるためによく行われるのが、メ...