ジェノタイピングの失敗のトラブルシューティング

KOマウスなどのジェノタイピングでバンドが出ない、不要なバンドが出過ぎてよくわからないなどの失敗に対処するためのチェック項目をまとめました。

DNAが抽出できない

抽出したDNAは溶液中に均等に溶けているのではなく、下のほうに沈殿していることがあります。
なのでPCR反応に使おうとしてDNA溶液の上のほうをピペットで取っても、実はDNAが含まれていません。
軽くピペッティングで溶液を混ぜてから使いましょう。

 

ジェノタイピングのPCRがかからない・バンドが出ない

まず、前提条件として、検出する各ジェノタイプ（多くの場合、+/+, +/-, -/-）のDNAを用意しましょう。
このDNAは、今までにジェノタイピングしたマウスのDNAで、うまく判定できたものを用います。
これらのDNAを、今回判定したいマウスから抽出したDNAと同時にPCRにかけます。
そしてこれらのPCR産物をアガロースゲル電気泳動します。

 

PCRが成功していれば、あらかじめ用意したDNAのバンドはちゃんと出ているはずです。
あらかじめ用意したDNAのバンドが正しく出ていない場合、PCRがうまくできていない可能性があります。
一方、今回判定したいマウスのバンドだけが出ていない場合、DNAの抽出に問題ある可能性があります。

 

PCRが失敗した場合、次のようなことを試してみましょう。

• サーマルサイクラーの設定を再確認する（間違っていることがたまにある）。
• サイクル数を増やしてみる。
• マウスの提供先からの情報どおりのプライマーを使う。
• ジェノタイピングのキットを使っている場合は、時間が経つと劣化してPCRがかからなくなる。使用期限の過ぎたキットは使わない。

 

自前の方法でジェノタイピングしていてバンドが出ない、PCRがかからないと困っている人には、市販のキットを使うことをおすすめします。
あれこれ悩んでいるのは時間と労力の無駄です。
ジェノタイピングのキットが高いと感じる場合は、使用量をスケールダウンして試薬を節約しましょう。
例えば、1回の液量が50uLで200回分のキットの場合、10uLでやれば1000回使えます（経験上、この液量でも問題なく使えました）。

ノンスぺのバンドが多すぎる

PCRのサイクル数が多すぎる場合はノンスぺのバンドが出やすくなります。
サイクル数を減らせば余計なバンドが消え、ジェノタイプを判断しやすくなります。

バンドが強すぎてよくわからない

使用するDNA量を減らす、PCRのサイクル数を減らすことで改善できる場合があります。
PCRに使うDNA量は多ければ良いというものではありません。