C2C12 myotube（筋管細胞）の分化のプロトコル

単核細胞であるC2C12 myoblastを多核細胞のmyotubeに分化させるときの方法を紹介します。
高めの倍率で観察すると、筋細胞がピクピクと収縮する様子が見られて面白いです。

準備試薬など

• C2C12myoblast
• 細胞培養ディッシュ
• DMEM（高グルコース）
• P/S（ペニシリン=ストレプトマイシン）
• FBS(Fetal Bovine Serum)：非働化しておく
• HS(Horse Serum)

培地調製

増殖培地：DMEMに1%PS、10%FBSを加える
分化培地：DMEMに1%PS、2%HSを加える

C2C12筋管細胞の分化誘導の方法

1. 増殖培地でC2C12 myoblastを懸濁し、ディッシュの底面積1cm^2あたり25,000-30,000個の割合で播種する。
2. 24時間後、ほぼ100%コンフルエントになっていることを確認
3. 増殖培地を捨て、分化培地に交換(Day 0)
4. 24時間後、分化培地を交換(Day 1)
5. 48時間後、分化培地を交換(Day 3)
6. さらに48時間後、分化培地を交換(Day 5)

コツと注意点

Day 5-6でだいたいmyotueの形成がピークに達しますが、使っている試薬などの影響で多少前後するかもしれません。
Myotubeの形成がピークに達した後、徐々にmyotubeの構造が崩壊していきます。

 

分化培地は毎日交換しないほうが良いです。毎日交換すると、myotubeの形成が悪くなります。
たとえば、ある薬剤が筋管形成に及ぼす影響を検討したい場合、薬剤入りの分化培地を毎日交換することもあります。
この場合、どうしても通常よりも分化が悪くなってしまいます。

 

筋管形成の程度を定量化して評価するには次のような方法があります。

• myotube diameter（筋管の横断方向の直径を測定する）
• myotube area（キャプチャした画像の範囲内でmyotubeがカバーしている面積を測定する）
• fusion index（キャプチャした画像に含まれる全核数に対する、筋管内に含まれる総核数の比）

 

継代数が進むと分化しにくくなるので、若い継代数のうちにたくさんストックを作っておくこと。
継代する場合は、コンフルエントになる前（50-70%くらい）に行うこと。