バイオ実験のプロトコルやコツ、試薬のレシピなど、初心者の方がつまずきやすい点を中心に解説中！
バイオ実験プロトコル「じっけん110番」このページにはプロモーションが含まれています。
メンブレンをCBB染色で均等なタンパク質量を確認
ウェスタンブロッティングで重要なのは各レーンに等量のタンパク質をアプライすることで、論文ではbeta-actinやalpha-tubulinなどのバンド検出を行い、各レーンで同じバンド強度であることで示しています。
ですが、バンド検出の終わった後に残ったメンブレンをCBB（クマーシーブリリアントブルー）染色することでも確認することができます。
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横向きになっていますがこんな感じになります。
ちなみに、一番下のレーンは分子量マーカーです。
CBB染色液の作成方法
- CBB 0.1g
- メタノール 40mL
- 酢酸 10mL
- 蒸留水 75mL
まず、CBBをメタノールと酢酸の混合液で溶かし、CBBが溶けた後に蒸留水を加えます。
この染色液はある程度の回数は再利用可能です。
使っていくうちに染色力が徐々に弱くなってきます、
「弱くなってきたな・・・」と思った時が作り直す時期です。
ウェスタンのメンブレン染色のプロトコル
- タッパーウェアなどにメンブレンが十分浸かる量のCBB溶液を入れ、そこにメンブレンを漬ける。
- 振とうさせながら5分程度室温でインキュベーションする。
- CBB溶液を回収し、代わりに蒸留水でメンブレンを加え、浸透させて洗浄する。
- 蒸留水は3〜5回程度、青色が出なくなるまで交換する。
- メンブレンが濡れている間は、タンパク質の電気泳動パターンが見えにくいので、ホコリが付かないところでメンブレンを放置乾燥させる。
- メンブレンが完全に乾くと、電気泳動パターンがくっきりと見える。
- 乾燥したメンブレンを素手で触ると指紋がついてしまうので、必ずピンセット等で取り扱うこと。